In vitro – сучасний метод розмноження рослин на практиці Частина II: Технологія розмноження в стерильних умовах – in vitro

 In vitro – сучасний метод розмноження рослин на практиці Частина II: Технологія розмноження в стерильних умовах – in vitro

Тадеуш Кусібаб, PLANTIN, Польща. Продовження. Початок в «Ягіднику» N1 (17), січень-березень 2020.

Дуже часто in vitro подається як процес розмноження шляхом культивування рослинних тканин. Звичайно, багато рослин відтворюються саме таким чином, проте у разі з лохиною ми використовуємо культуру in vitro, тобто вирощування на стерильних середовищах: не тканин, а органів – частин рослини – пагонів з листям. Вони, щоправда, мініатюрні, але мають листя, міжвузля, бічні бруньки та конус росту.

Культура лохини високої, або власне культури складних гібридів різних видів лохини, зберігаються в стерильних умовах і в посуді, що містить стерильне поживне середовище. Майже сорок років тому, на початку нашої роботи з культурами лохини in vitro, вибір сортів, рекомендованих для нашого клімату, обмежувався майже виключно гібридами різних форм Vaccinium corymbosum та V. angustifolium.

Сьогодні, коли площі лохини значно розширились і її вирощуванням займаються в країнах з теплим кліматом, без періоду зимових холодів, у вирощуванні з’явилися чудові гібриди вищезгаданих «північних» видів лохини з такими «південними» видами, як V. ashei, V. darrowi або V.elliottii. Ці види походять із теплого клімату, і гібриди принесли не тільки толерантність до високих температур, але й здатність закладати квіти та формувати фрукти в кліматичних умовах зі значно коротшим періодом низьких температур у період спокою (lowchill) або навіть без періоду переохолодження взимку (no chill). Поява гібридів з південними видами потребувала певної зміни технології розмноження, включаючи модифікацію складу поживних середовищ. Однак, незалежно від походження сорту, відтворення in vitro є подібним.

ПІДГОТОВКА МАТЕРИНСЬКИХ РОСЛИН ДО ІЗОЛЯЦІЇ – ЗАКЛАДАННЯ ВИХІДНИХ КУЛЬТУР

Перед закладанням вихідних культур необхідно підготувати материнські рослини до збору матеріалу, з якого і будуть закладені вихідні, або початкові культури. Наші материнські рослини походять із відомого джерела, відповідно промарковані, постійно контролюється стан їхнього здоров’я, вони мають підтверджену ідентичність. Для обмеження чисельності мікроорганізмів, наявних на різних органах лохини, материнські рослини завжди поливають у такий спосіб, щоб не мочити пагони та листя. Додатково виконується обприскування дезінфікуючими засобами поверхні пагонів і листя рослин, призначених для ізоляції. Пагони, відведені для закладки вихідних культур, повинні бути без шкідників та будь-яких видимих ознак захворювань. Якщо це не так, ізоляція приречена на провал.

Найкращий час для закладення вихідних культур лохини – початок літа, коли пагони майже здерев’яніли, а бічні (вегетативні) бруньки добре розвинені. Всі операції – обрізання пагонів, видалення листових пластинок, розрізання пагонів на міжвузлові ділянки, транспортування – проводяться за допомогою стерильних рукавичок і санітарних засобів. Ми беремо для ізоляції пагони з верхівки цьогорічних сильних приростів.

Маркування контейнерів з відібраними пагонами обов’язкове. Воно містить ідентифікацію материнської рослини, номер ізоляції та заповнену ізоляційну картку. Вся ця «бюрократія» спрямована на те, щоб уникнути людських помилок і задокументувати весь операційний процес. Якщо ми проводимо ізоляцію з доставленогоматеріалу, його постачальник-замовник заздалегідь отримує від нас детальні інструкції щодо відбору зразків та доставки матеріалу до лабораторії. Найголовніше – щоб матеріал, який підлягає ізоляції, одразу після збирання охолоджувався і транспортувався «насухо», бажано щільно загорнутим у м’який паперовий рушник. Таким чином ми уникаємо розвитку мікроорганізмів на поверхні пагонів, призначених до ізоляції.

У нашій практиці процес розмноження in vitro лохини складається з 4 фаз:

Фаза I – стерилізація рослинного матеріалу та розміщення експлантів у поживному середовищі – ізоляція:

а) видаляємо листові пластинки з пагонів, призначених для ізоляції, ділимо пагони на міжвузлові відрізки;

б) попередньо дезінфікуємо пагони 0,2% перекисом водню протягом кількох хвилин;

в) промиваємо пагони протягом 10 хвилин у стерильній проточній воді;

г) дезінфікуємо матеріал протягом 3–12 хвилин у розчині, що містить активний хлор та засіб для зменшення поверхневого натягу, час стерилізації залежить від ступеня здерев’яніння пагонів та їхнього стану;

д) промиваємо в проточній стерильній воді протягом 15 хвилин;

е) висушуємо пагони на папері і після зрізання нижньої частини кладемо їх у невеликі пробірки діаметром 15 мм з поживним середовищем, зазвичай це середовище Андерсона з додаванням 2-iP, цитокініну, що стимулює розвиток бічних бруньок;

ж) розміщуємо ці пробірки у вегетаційному приміщенні при температурі 23 °С, на освітлених полицях ФAP ~ 40 мкм, 16h /24h. Молоді пагони починають розвиватися з бруньок уже через тиждень. За цей час ми щодня перевіряємо культури та видаляємо пробірки з проявами інфекцій.

Фаза II – інкубація – стабілізація культур, створення банку резервних культур, роль холодильної камери:

а) кожні 2 тижні переносимо пагони з бруньками, що розвиваються, на свіже поживне середовище. Повторюємо цю процедуру кілька разів, поки інфікування не зникне, а молоді зелені пагони досягнуть 2–3 см з вираженими міжвузлями;

б) далі відбираємо молодий зелений пагін і з нього під мікроскопом вирізаємо верхівкову меристему з навколишньою тканиною – такий фрагмент зазвичай розміром близько 1 мм. Цю верхівкову меристему поміщаємо в невелику пробірку з поживним середовищем і ставимо у вегетаційне приміщення з певними умовами: температура 22 °C, освітлення 16h / 24h, ФAP ~ 80 мкм;

в) пагони набирають росту, спочатку повільно, кожні 10–14 днів перекладаємо їх у свіже середовище, поки ріст не стабілізується і з’явиться мініатюрне, характерне листя і не зникне надмірна гідратація пагонів (вітрифікація), а з бічних бруньок почнуть розвиватися крихітні пагони, утворюючи пучки і даючи фактичне розмноження in vitro. Важливо, щоб нові пагони, які мають сформувати пучок, з’явилися в результаті розвитку бічних бруньок материнського пагона, а не при його основі з калюсу. Пагони, що розвиваються з калюсу, з’являються у великій кількості, але ми не використовуємо їх у процесі розмноження лохини.

Існують значні відмінності в тривалості періоду стабілізації культури, залежно від сорту. Стабілізація культур триває 2–3 місяці у сортів, «легких» для розведення, як-от Bluegold або Bluecrop, і може тривати набагато довше, до 12 місяців – як у випадку із сортом Chandler або Star.

Бічні пагони лохини, що утворюють мікропучки, є джерелом найціннішого матеріалу для подальшого розмноження in vitro. Зазвичай за раз збирають і виділяють кілька сотень зрізів окремих чорничних пагонів, залежно від виробничих планів.

Після стабілізації культур стерильний матеріал у виробничому посуді, як правило в одноразових місткостях, поділяють на 3 частини: A, B, C. Частина A призначена для розмноження відповідно до виробничих потреб, а частини B і C зберігають у холодильній камері при температурі 2 °C, в темних, захищених від зараження та пересихання умовах.

Рослини, що містяться в холодному приміщенні (частини B і C), не розмножуються, а поживне середовище не змінюється навіть протягом декількох років. Ці частини є цінним захисним засобом проти можливого зараження культур або виступають як розмножувальний матеріал для потреб виробництва, якщо раніше розмножена частина не може (або не повинна) надалі підлягати розмноженню.

Фаза III – розмноження в потрібних обсягах:

a) коефіцієнт розмноження in vitro лохини становить від 1:2 до 1:10 і більше протягом одного циклу 4–6 тижнів. Цей фактор залежить від сорту рослини і виду регуляторів росту, їхньої форми та концентрації. У нашій практиці ми використовуємо такі типи цитокінінів і в таких концентраціях, які дають нам репродукцію більше ніж 1:5. Якщо припустити розмноження 1:5 і тривалість одного розмножувального циклу 6 тижнів – з одного початкового пучка (або першої мікророслини) лохини можна отримати протягом 8 циклів розмноження тривалістю близько року понад 300 тисяч мікропагонів in vitro.  На практиці для розмноження використовують кілька початкових мікророслин, що значно скорочує час, необхідний для отримання запланованої кількості рослин, і зменшує кількість циклів розмноження. Мета III фази – отримати потрібну кількість пагонів для вкорінення в парникових умовах;

б) у практиці фірми Plantin процес розмноження, як правило, триває протягом декількох місяців у році, що передує виробництву розсади в касетах (мультиплатах) у теплицях та розплідниках. У період, що залишився, «продукційний» матеріал in vitro, який не підлягає розмноженню в даний час, наприклад надлишкова кількість місткостей з розмноженою лохиною, зберігається в холодильній камері. В результаті багаторазового і довготривалого розмноження in vitro можуть з’являтися рослини, які за певними ознаками відрізняються від материнських. Такі загрози виникають під час кожного інтенсивного процесу розмноження. Однак під час відтворення in vitro, завдяки його масштабам та специфічності, ми особливо дбаємо про те, щоб процес відтворення здійснювався обмежено. Практично розмноження in vitro можна проводити багато разів, протягом багатьох років, використовуючи ту саму початкову культуру (клон), особливо для таких важливих видів, як лохина чи малина. Ми ж ніколи не допускаємо появи такої ситуації. Це гарантія збереження найвищого рівня безпеки процесу відтворення in vitro. Серед сортів лохини є такі, які ми розводили вже багато років і у великих масштабах, наприклад сорт Duk або Bluecrop. Наразі ми розводимо сорт Дюк з ізоляції під номером 28-30, сорт Bluecrop – 17-20. Тільки часте оновлення культур гарантує безпеку;

в) отримання запланованої кількості мікророслин лохини, тобто їхнього фактичного розмноження in vitro, завершує процес розмноження, хоча рослини ще залишаються в стерильних умовах.

Фаза IV – подовження (pre-rooting) остання фаза в стерильних умовах

Під час процесу розмноження in vitro рослини отримують усі необхідні для життя інгредієнти в живильному середовищі, перебуваючи в умовах низької інтенсивності світла та підвищеної вологості. Їхній апарат для засвоєння і транспірації ще не досягнув такого рівня, щоб вони могли виживати в теплиці чи розсаднику. Світло в умовах відтворення in vitro відіграє певну асиміляційну роль (джерела енергії для росту та розвитку), але завдяки складу спектра, придатного для фази розвитку, він відіграє роль певного коректора, стимулюючи, наприклад, процес росту пагона або формування коренів.

Рослини, отримані в результаті розмноження in vitro, не мають кореневої системи, вони не потребували її протягом усього періоду in vitro. Перший етап підготовки до повної самостійності, тобто в умовах in vivo, – це розміщення окремих мікророслин у посуді з поживним середовищем, що стимулює видовження організму рослини (pre-rooting). Окрім повного набору макро- і мікроелементів, поживне середовище містить цукор, аби забезпечити рослини енергією, та ауксин для стимулювання утворення кореневої системи. Ми використовуємо низькі концентрації ауксинів – кислоти IОК, IМК та НОК, щоб дати рослинам імпульс до формування коренів.

Разом зі світлом, що містить у своєму спектрі переважання червоного і віддаленого червоного, ми створюємо умови для швидкого росту: рослини на цьому поживному середовищі виростають за 2 тижні до 3–4 см. Вони готові залишити стерильні умови та пристосуватися до умов самостійного живлення.

Фаза IV завершує процес розмноження лохини in vitro. Процес адаптації та вкорінення рослин, отриманий в результаті розмноження in vitro, буде описаний у третій частині статті про розмноження лохини у фірмі Plantin.

Журнал «Ягідник»

0 Reviews

Написати відгук

Останні статті

Залишити коментар

Ваша e-mail адреса не оприлюднюватиметься. Обов’язкові поля позначені *